双缩脲试剂检测蛋白质原理(蛋白质检测)
双缩脲试剂检测蛋白质原理
双缩脲试剂使用时,先加入NaOH溶液(2mL),振荡摇匀,造成碱性的反应环境,然后再加入3~4滴CuSO4溶液,振荡摇匀后观察现象。(不加热)
使用蛋白酶抑制剂,防止蛋白酶对目标蛋白的降解;在纯化细胞中的蛋白质时,加入DNA酶,降解DNA,防止DNA对蛋白的污染。
由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键,也能发生双缩脲反应,因此,蛋白质中的双缩脲(H2NOC—NH—CONH2)结构在碱性溶液(NaOH)中与*铜溶液中的Cu2+作用,发生颜色反应形成紫色的络合物。所以双缩脲试剂可以鉴定蛋白质是由于蛋白质中有很多与双缩脲结构相似的肽键。
待测组分的吸收光谱选择最大吸收波长作为测量波长。如果干扰组分在最大吸收波长也有吸收,则应根据“吸收大,干扰小”的原则选择波长。
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蛋白质检测
斐林试剂使用时,先等体积混合甲、乙两液,而后立即使用,反应需要加热(有时不加热也反应);双缩脲试剂使用时,先加入NaOH溶液(1mL),振荡摇匀,造成碱性的反应环境,然后再加入3~4滴CuSO4溶液,振荡摇匀后观察现象。
斐林试剂是新配制的溶液,它在加热条件下与醛基反应,被还原成砖红色的沉淀,可用于鉴定可溶性还原糖的存在。用斐林试剂鉴定可溶性还原糖时,溶液的颜色变化过程为:浅蓝色→棕色→砖红色(沉淀)。
斐林试剂常用于鉴定可溶性的还原性糖的存在,斐林试剂可与还原性糖反应生成砖红色沉淀。双缩脲试剂是一种用于鉴定蛋白质的分析化学试剂。二者溶液浓度不同、使用原理不同、使用方法不同。
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蛋白质是一种十分重要的生物大分子,其种类很多,结构多样,分子量相差也很大,因此建立一个比较通用或标准的定量方法是比较困难的。目前,测定蛋白的方法有多种,其优缺点也各不相同,因此,针对不同的目的,选择合适的蛋白测定方法尤为重要。目前常用的测定蛋白浓度的方法主要包括:紫外分光光度法、双缩脲法、Lowry法、Bradford法、BCA法、磺基水杨酸法、荧光染料定量法。
双缩脲可以检测二肽吗
检测原理:双缩脲是由两分子*素缩合而成的化合物,在碱性溶液中与*铜反应生成紫红色络合物,此反应即为双缩脲反应。蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似,在碱性溶液中也能与Cu2+络合成紫红色化合物(540nm)。其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比,而与蛋白质的分子量及氨基酸的组成无关,该方法适用于测定蛋白质浓度范围为1~10mg/mL。
检测原理:蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环中含有共轭双键,因此,蛋白质具有吸收紫外光的性质,其最大吸收峰位于280nm附近。在最大吸收波长处,吸光度与蛋白质溶液的浓度服从郎伯-比尔定律。
检测原理:BCA法基于双缩脲原理,碱性条件下蛋白质将Cu2+还原成Cu+,再使用BCA鳌合Cu+作为显色剂,产生蓝紫色并在562nm有吸收峰,颜色的深浅与蛋白质呈剂量相关性,可以根据在562nm处的吸光度计算待测蛋白浓度。
